Микроскоп.
В этой статье расскажу 3 способа приготовления препаратов для микроскопа. Эти способы - самые простые.
В начале статьи - так называемый словарик, а точнее пояснения, что такое тот или иной предмет.
Для изготовления микропрепаратов требуется специальный инструмент, красители, а также определенная аккуратность и сноровка. Очень важно строгое соблюдение всех необходимых условий – иначе микропрепарат может оказаться непригодным для исследований.
В продаже есть готовые наборы препаратов для исследований (что удобно для дома и школы) - например, 25 препаратов , или 38 слайдов от Левенгук . А также минералы и другие наборы.
пояснения
Фиксированный препарат - в микробиологии часто готовят именно фиксированные препараты, так что следует знать, что это такое. Эти препараты рассматривают под микроскопом именно в окрашенном виде. Под словом "фиксация" имеется ввиду такая обработка живого объекта (который вы собираетесь рассмотреть), которая дает возможность быстро прервать жизненные процессы в том или ином объекте (поясню проще - убить), при этом сохранив тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микроорганизмами (в целях самобезопасности).
Суспензия - смесь каких-либо веществ, где твёрдое вещество распределено в виде мельчайших частиц в жидком веществе в неосевшем состоянии.
Биологическая петля - тонкая металлическая палочка, на конце - тонкая металлическая петля. Используется для захватывания маленького количества той или иной суспензии микроорганизмов.
Вазелин - мазеобразная жидкость без запаха и вкуса. Смесь состоит из минерального масла и твёрдых парафинов (воскоподобная смесь).
Герметизация - обеспечение совершенной непроницаемости для разных газов и жидкостей поверхностей и мест соединения деталей.
Агар-агар - в микробиологии используется для изготовления плотных и полужидких питательных сред, то есть агаризованных сред.
Жидкость Карнуа - жидкость для фиксации.
Горелка - устройство, имеющее инжектор, который установлен в металлической трубке с отверстиями для поступления в эту трубку атмосферного воздуха, которая закреплена на подставке с боковым вводом для подачи в трубку газа, при этом отверстия выполнены на боковой поверхности трубки, на которой для изменения подачи воздуха в горелку, может быть установлена подвижная заслонка, изменяющая площадь проходного сечения этих отверстий.
Смесь Никифорова - смесь равных объемов этилового спирта и безводного серного эфира, применяется для фиксации мазков крови, мазков-отпечатков органов и каких либо тканей.
Приготовления препарата "раздавленная капля"
- Убедитесь, что ваше предметное стекло обезжиренное и чистое.
- Нанесите 1-2 капли воды на предметное стекло.
- Аккуратно положите объект изучения.
- Аккуратно накройте каплю с объектом изучения покровным стеклом. Если вода при накрывании капли покровным стеклом вышла за его пределы, аккуратно удалите её фильтрованной бумагой.
- Препарат "раздавленная капля" готов! Приступайте к его изучению.
Приготовление препарата "висячая капля"
Висячая капля.
- Одну каплю суспензии микроорганизмов (заранее приготовленной) с помощью биологической петли аккуратно нанесите на чистое покровное стекло.
- Переверните покровное стекло с каплей суспензии так, чтобы капля свободно висела.
- Поместите перевёрнутое покровное стекло с каплей над лункой специального покровного стекла с углублением в центре.
- Капля не должна касаться краёв стекла и углубления (лунки), она должна свободно висеть на покровном стекле.
- Края углубления специального покровного стекла предварительно смазывают вазелином для герметизации камеры.
- Наслаждайтесь наблюдением за бактериями в микропрепарате!
Приготовление препарата "отпечаток"
- Препарат готов!
- Внимание! Препараты живых клеток рассматривают с помощью "сухих систем" микроскопа. После микроскопирования такие препараты перед мытьем должны быть выдержаны в дезрастворе (дезинфицирующее средство).
Из агаризованной среды, на которой какие-либо микроорганизмы растут абсолютным сплошным газоном или же в виде отдельных колоний, аккуратно вырежете скальпелем не очень большой кубик.
Перенесите его на предметное стекло таким образом, чтобы поверхность кубика с микроорганизмами была обращена именно вверх.
Затем к газону микроорганизмов или к колонии приложите обычное покровное стекло (абсолютно чистое), аккуратно и не сильно, а слегка, надавите на него биологической петлей или пинцетом и тотчас снимите, стараясь не сдвинуть его в сторону.
Полученный препарат (покровное стекло с отпечатком) помещают именно отпечатком вниз в каплю обычной воды на чистое предметное стекло. Отпечаток также можно получить и на предметном стекле, если касаться поверхности колонии предметным стеклом.
Приготовление препарата "отпечаток", иной способ
- Дайте отпечаткам подсохнуть и поместите стекло в жидкость Карнуа для фиксации клеток.
- Готово!
Чашка Петри.
Из агара в чашке Петри с засеянными на нем бактериями (бактериальным газоном) вырежьте блок.
Возьмите обезжиренное чистое стекло и приложите его к поверхности блока агара, засеянного бактериями. Получился первый отпечаток, Отпечатки делайте до тех пор, пока бактериальный слой на блоке не истощится, располагая их слева направо начиная с левой короткой грани стекла.
Приготовление препарата "фиксированный мазок"
- Готово!
Для того, чтобы приготовить этот препарат, требуется на обезжиренное предметное стекло нанести одну каплю воды.
В неё биологической петлей внесите исследуемый вами материал и распределите его так, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром примерно 1-1,5 сантиметра (только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки).
Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то петлей его непосредственно наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.
Для фиксации мазка предметное стекло (именно мазком вверх) очень аккуратно и медленно проводят 3 раза (в течение всего 3 секунд) через пламя горелки. Микроорганизмы, находящиеся в мазке, при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности предметного стекла, и они не смываются при дальнейшей обработке препарата.
Внимание! Более долгое нагревание может вызвать деформацию структур клеток. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и каких-либо тканей и (в некоторых случаях и мазки из культур), фиксируют погружением на 5-20 минут в метиловый синий или этиловый спирт, смесь Никифорова, также сулемовый спирт или иные фиксирующие жидкости.
Примеры микропрепаратов для микроскопа
Ботаника и зоология:
Кожица лука
Зерновка ржи
Корневой чехлик
Ветка липы
Пыльник
Завязь
Камелия
Эпидермис листа герани
Конечность пчелы
Крыло пчелы
Циклоп
Вольвокс
Эвглена
Инфузория-туфелька
Дождевой червь (поперечный срез)
Ротовой аппарат комара
Аскарида
Дафнии
Биология и физиология:
Мутация дрозофилы (бескрылая форма)
Мутация дрозофилы (черное тело)
Дрозофила "норма"
Животная клетка
Растительная клетка
Плесень мукор
Дробление яйцеклетки
Митоз в корешке лука
Поперечно-полосатые мышцы
Сперматазоиды млекопитающего
Нерв (поперечный срез)
Рыхлая соединительная ткань
Яйцеклетка млекопитающего
Нервные клетки
Гиалиновый хрящ
Гладкие мышцы
Костная ткань
Кровь лягушки
Кровь человека
Однослойный эпителий
Макроскопический анализ
Макроскопический анализ является основным методом определения подлинности цельного сырья по внешним морфологическим признакам. При проведении этого анализа обращают внимание на 1) внешний вид сырья, 2) размеры, 3) цвет, 4) запах и 5) вкус.
1) Внешний вид сырья определяют невооруженным глазом или при помощи ручной лупы с десятикратным увеличением.
2) Размеры сырья определяют с помощью миллиметровой линейки или раскладывая сырье на миллиметровой бумаге. Для объективного суждения о размерах частей сырья необходимо провести несколько измерений, для более мелких объектов - до 10-20 измерений.
3) Цвет сырья определяют при дневном освещении. При этом отмечают его цвет с поверхности, а также в изломе или на разрезе.
4) Запах сырья определяют при растирании или разломе, твердые объекты скоблят скальпелем или растирают в ступке.
5) Вкус сырья определяют на последнем этапе анализа, когда выяснено, что анализируемое сырье не ядовито. Для этого, взяв в рот не большие кусочки сырья, осторожно жуют их, не проглатывая, и, определив вкус, выплевывают. Для ядовитых объектов вкус не определяется.
Характерные внешние признаки сырья изучают как на сухом материале, так и на размоченном или увлажненном.
Схемы для морфологического описания
лекарственного растительного сырья:
I. Листья /Folia/
1. Товарный вид сырья (полный лист или его части).
2. Тип листа (простой, сложный).
3. Размеры листовой пластинки.
4. Форма (очертания) листовой пластинки (линейный, округлый, яйцевидный и др.)
5. Характер края листовой пластинки.
6. Характер жилкования.
7. Наличие или отсутствие черешка.
8. Опушение.
12. Специфические особенности.
II. Цветки /Flores/
1. Товарный вид сырья (соцветия или их части, отдельные цветки или их части).
2. Тип соцветия. Строение соцветия (наличие различных типов цветков в соцветии, их взаимное расположение).
3. Строение цветка (особенности околоцветника, характер андроцея и гинецея, положение завязи).
4. Размеры цветка или соцветия.
5. Наличие и длина цветоножек.
6. Наличие прицветных листьев (прицветников). Их форма и размер.
7. Опушение.
III. Кора /Cortex/
1. Форма кусков коры: плоские, желобовидные, трубчатые, желобовидно перекрученные.
2. Размеры (длина, толщина).
3. Характер наружной поверхности (гладкая, шероховатая, характер чечевичек и т. д.).
4. Характер излома: ровный, неровный, зернистый, волокнистый, занозистый, щетинистый.
5. Цвет (с наружной стороны, с внутренней стороны).
6. Запах при соскабливании.
IV. Плод /Fructus/
1. Товарный вид сырья: целые плоды или их части, соплодия.
2. Форма плода (соплодия).
3. Размеры (длина, ширина, толщина).
4. Наличие и размер плодоножек.
5. Характер поверхности кожуры (голая, опушенная, наличие ребрышек, остатки чашечки, прицветников и т. д.).
6. Количество косточек или семян, их форма, размер, окраска.
V. Семя /Semen/
2. Размеры.
3. Характер поверхности (гладкая, опушенная, ячеистая, голая, бугорчатая и т. д.)
4. Наличие рубчика (семяшва)
5. Форма, размеры и расположение зародыша на поперечном срезе.
VI. Трава /Herbaе/
1. Товарный вид сырья (цельное, обмолоченное, цветоносные верхушки и др.)
2. Стебель: форма, характер ветвления, размер (длина, толщина, травянистый или деревянистый).
3. Листорасположение, характер прикрепления к стеблю.
4. Листья: форма, размер, жилкование, край листовой пластинки.
5. Тип соцветия, строение цветка, размеры.
6. Строение и форма плодов, их размеры.
7. Характер опушения.
VII. Корни /Radices/, корневища /Risomata/, корневище и корень / Risomata et radices/, корневища с корнями /Risomata cum radicibus/, луковицы /Bulbi/, клубни /Tubera/, клубнелуковицы /Bulbotubera/.
1. Товарный вид сырья (корень, корневище, корневище и корень, столоны и т.д.; цельное, резаное, очищенное, неочищенное).
3. Размеры (длина, ширина, толщина)
4. Характер поверхности (наличие продольных и поперечных складок, рубцов от листьев, стеблей, корней)
5. Характер излома (ровный, неровный, волокнистый, щетинистый, занозисто-деревянистый, зернистый)
6. Цвет снаружи
7. Цвет на свежем изломе
Микроскопический анализ.
Микроскопический анализ основан на определении признаков анатомического строения. Цель анализа – установление подлинности сырья. Для этого в общей картине анатомического строения различных органов и тканей отыскивают характерные диагностические признаки, по которым изучаемый объект можно отличить от других. При проведении этого анализа рассматриваемый объект помещают на предметное стекло в капле жидкости, накрывают покровным стеклом и рассматривают сначала при малом, а затем при большом увеличении микроскопа.
Техника приготовления микропрепаратов.
Приготовление препарата зависит от морфологической группы сырья и его состояния – цельное, резаное, порошкообразное.
Листья. Из тонких листьев готовят поверхностные микропрепараты. При исследовании цельного сырья берут кусочки пластинки листа с краем и жилкой, мелкие листья берут целиком.
Несколько кусочков сырья помещают в фарфоровую чашку, прибавляют 5% раствор едкого натра, разведенный водой (1:1), и кипятят в течение одной - двух минут. Затем содержимое выливают в чашку Петри, жидкость сливают, а сырье тщательно промывают водой. Из воды сырье вынимают скальпелем или препаровальной иглой, помещают на предметное стекло, убирают остатки воды фильтровальной бумагой и наносят каплю раствора хлоралгидрата или глицерина. После этого кусочек сырья разделяют скальпелем или препаровальной иглой на две части, одну из них осторожно переворачивают. Объект накрывают покровным стеклом, слегка подогревают до удаления пузырьков воздуха и, после охлаждения, рассматривают лист с обеих сторон под микроскопом.
При исследовании толстых кожистых листьев готовят поперечные срезы. Для этого сухие листья размачивают в воде, затем помещают в смесь воды, спирта и глицерина (1:1:1). Из размягченного листа делают поперечные срезы. Для размягчения сухих листьев их также можно прокипятить в воде в течение 10-20 минут.
При исследовании резаного сырья микропрепараты готовятся такими же способами.
При исследовании порошков листьев на предметное стекло наносят 2-3 капли хлоралгидрата, в них помещают небольшое количество исследуемого порошка, размешивают препаровальной иглой порошок, накрывают покровным стеклом и подогревают 2-3 минуты для просветления тканей листа. Для просветления также можно взять 3% раствор NaOH. При нагревании надо следить, чтобы препарат не высох. После нагревания покровное стекло слегка потирают о предметное, чтобы частицы порошка легли более тонким слоем, не накрывая друг друга. Если в качестве просветляющей жидкости использовался NaOH, добавляют 1-2 капли глицерина, нанося их рядом с покровным стеклом, так чтобы глицерин затянуло под покровное стекло.
Цветки. Для приготовления микропрепаратов из цветков и соцветий исследуемый материал предварительно кипятят в воде в течение 2-3 минут (иногда для этого используют 2-3% раствор NaOH, в этом случае после кипячения материал тщательно промывают водой). Отдельные цветки или их части помещают на предметное стекло в каплю включающей жидкости, накрывают покровным стеклом и рассматривают препарат с поверхности.
Трава. Определение трав ведется главным образом по листьям, поэтому для микроскопического анализа чаще всего используют листья. Приготовление препарата см. выше.
При исследовании безлистных трав готовят препараты эпидермиса стебля и поперечные срезы. Эпидермис снимают скальпелем после предварительного кипячения в 5% растворе NaOH, разбавленном водой (1:1). Для приготовления поперечных срезов стебли предварительно размягчают (методы размягчения такие же, как и для листьев).
При исследовании резаных трав выбирают наиболее крупные кусочки листьев и стеблей. Из стеблей иногда готовят «давленые» препараты. Для этого кусочки стеблей разваривают в 3-5% растворе NaOH для мягкости и раздавливают скальпелем на предметном стекле. Полученную массу помещают в глицерин или хлоралгидрат и накрывают покровным стеклом. Микроскопическая картина таких препаратов напоминает продольные срезы.
Из порошков трав микропрепараты готовят также как из порошков листьев.
Подземные органы. Для микроскопического анализа подземных органов обычно готовят препараты поперечных срезов, реже продольных. Предварительно корни, корневища или другие подземные органы размачивают. Для этого небольшие куски корня или другого подземного органа помещают в холодную воду и выдерживают около суток, затем переносят в смесь спирта с глицерином (1:1) на 3 - 5 суток. Поперечные срезы тонких корней должны пройти через весь поперечник корня, для более толстых корней, корневищ и других подземных органов достаточно сделать срез части поперечного сечения, но в нем обязательно должны быть представлены все ткани, начиная с пробки (эпидермиса) и кончая центральной частью. Общую картину строения изучают, рассматривая препарат при малом увеличении, детали структуры - при большом.
Резаное и дробленое сырье. Кусочки корней и корневищ кипятят в растворе 3-5 % щелочи (или воды). Затем расщепляют иглами или скальпелем (желательно в радиальном направлении) и рассматривают препараты в хлоралгидрате («давленый» препарат). Для выявления характера расположения проводящей системы у крупных кусочков корней и корневищ скальпелем выравнивают излом, смачивают его спиртовым раствором флороглюцина и наносят одну каплю концентрированной соляной кислоты. Элементы ксилемы окрашиваются при этом в малиново-красный цвет. В «давленых» препаратах при определении имеет большое значение вторичное утолщение стенок древесных сосудов; из механических элементов встречаются волокна, реже каменистые клетки и слабо утолщенные клетки эндодермы. В паренхиме часто содержатся кристаллы оксалата кальция. Иногда встречаются секреторные ходы и млечники.
Порошок. Небольшое количество порошка (на кончике иглы) вносят в каплю хлоралгидрата на предметном стекле, размешивают иглой до равномерной взвеси, накрывают покровным стеклом и рассматривают строение крахмальных зерен; затем препарат подогревают и изучают строение других анатомических элементов. Микроскопическое определение порошкованного сырья основано на анатомическом строении тканей и характерных включений в клетках (кристаллы, крахмал, инулин, слизь).
Важное место в диагностике резаного и порошкованного сырья занимают микрохимические реакции.
Кора. Для микроскопического исследования коры обычно готовят поперечные срезы, реже – продольные. Предварительно кусочки размягчают в воде, затем переносят в смесь вода-глицерин-спирт (1:1:1). Для размягчения цельного сырья его также можно прокипятить в воде в течение 5 -10 минут. Размягченные куски коры выравнивают лезвием или скальпелем, придавая поверхности среза строго перпендикулярное или продольное направление. Срезы готовят бритвой или бритвенным лезвием. Полученные срезы помещают в раствор хлоралгидрата или глицерина и нагревают для просветления и удаления воздуха. При необходимости препараты окрашивают для выявления различных структур или веществ.
Изучая поперечные срезы, обращают внимание на толщину и характер строения пробки, на наличие колленхимы, на соотношение толщины первичной и вторичной коры, ширину сердцевинных лучей. Важное значение имеют также лубяные волокна и каменистые клетки, их строение, расположение и количество.
Строение и размер волокон лучше видно на продольных срезах. Кроме того в коре некоторых растений имеются млечники или вместилища с эфирными маслами. Почти всегда имеются кристаллы оксалата кальция.
Порошки коры характеризуются отсутствием элементов ксилемы и определяются главным образом по механическим элементам, которые встречаются здесь в виде отдельных клеток или лежат группами или пучками. Большое значение при микроскопии порошков имеют также кристаллы оксалата кальция, обрывки пробки (особенно если она имеет характерный цвет).
Плоды, семена. Для микроскопического исследования плодов и семян готовят поверхностные препараты и поперечные срезы.
Для приготовления препаратов кожуры и околоплодника с поверхности 2-3 семени или плода кипятят в растворе 5% NaOH в течение 2-3 минут, после чего промывают их водой. Объект помещают на предметное стекло, препаровальными иглами отделяют кожуру семени или ткани оклоплодника и рассматривают их в растворе хлоралгидрата или глицерина.
Для приготовления срезов сухие плоды и семена предварительно размягчают, поместив их на сутки во влажную камеру (эксикатор с водой в которую добавлено несколько капель хлороформа) или водяным паром в течение 15-30 мин или более в зависимости от твердости объекта.
Мелкие плоды и семена помещают в парафиновый блок размером 0,5х0,5х1,5 см. Парафин расплавляют с узкой стороны блока кончиком нагретой препаровальной иглы и в образовавшуюся ямку погружают семя или плод, которые должны быть сухими. Срезы делают бритвой через объекты вместе с парафином. Из парафина срезы выбирают препаровальной иглой, смоченной жидкостью, окрашивают и готовят микропрепараты в растворе глицерина или хлоралгидрата.
Препараты порошков плодов и семян готовят так же, как это описано в разделе листья. В качестве просветляющей жидкости используют раствор хлоралгидрата или 5% раствор NaOH.
Объекты, которые рассматривают с помощью микроскопа, принято называть микропрепаратами, или просто препаратами (так как далеко не все из них имеют микроскопический размер). В микробиологии как правило это предметное стекло, на которое помещён объект изучения, и накрыт покровным стеклом. Интересна история его возникновения: в середине 17 столетия в качестве таких стёкол использовали кусочки прозрачной слюды. Но поскольку слюда весьма хрупка, их было легко повредить. А главное что не были стандартизированы размеры самих покровных стекол, из-за чего хранение препаратов превращалось в настоящее мучение.
При транспортировке препараты портились, потому что фиксация, препятствующая их разложению, была слабой или вовсе отсутствовала. Не были еще разработаны методы длительного хранения препаратов. Для решения этих проблем представители Королевского Микроскопического Общества Лондона на учёном совете представили свою инновацию – стандартное стекло для микроскопа, которое имело прямоугольную форму и определённый размер - 3 на 1 дюйм, что составляет 7,5 на 2,5 сантиметра. Также стекло имеет стандартную толщину 1 миллиметр.
Существует две классификации микропрепаратов, которые определяются по таким признакам, как время его хранения, и характер изучаемого объекта.
К первому типу классификации относятся временные и постоянные препараты:
Временный препарат – для изготовления которого нужно относительно мало времени, с достаточно ограниченным сроком использования. При правильном хранении объект можно изучать от 1 до 3 дней. В серьезных лабораторных условиях сначала производят фиксацию препарата. Она заключается в антисептическом воздействии на препарат с помощью формалина или спирта, либо с помощью нагрева. В противном случае, скоропортящийся препарат может повредиться под действием гнилостных микроорганизмов, либо из за распада собственных «быстрых» белков. Затем опционально производится окраска препарата для повышения контраста при наблюдении в проходящем свете. Такой препарат обычно бывает влажным: в каплю воды, или красителя помещается изучаемый объект, накрывается покровным стеклом – препарат готов. Особенно хорош для любительских исследований спиртовый раствор йода: он служит одновременно и антисептическим фиксатором и окрашивающим реагентом, только нужно не переусердствовать с его количеством (капля должна быть совсем небольшой). Также можно использовать глицериновый желатин и физиологический раствор. Если это сухой микросрез, то он зачастую фиксируется без помощи влажной среды. Профессионалы в лабораториях закупают готовые детергенты (очистители), дилюенты (снижающие плотность раствора) окрашивающие и фокусирующие реагенты, которые бывают различными в зависимости от производимого типа исследований.
Многие объекты наблюдений требуют длительных исследований или нелегки в приобретении. Подобные ценные препараты стараются законсервировать на годы. Постоянный препарат требует более тщательной подготовки и может оставаться пригодным для изучения на протяжении целых десятилетий. Существуют различные типы фиксаторов для такого рода препаратов. Одним из лучших вариантов является использование так называемого канадского бальзама. На экологически чистых просторах Канады растет уникальное хвойное дерево - бальзамическая пихта. Из ее коры в летний период добываются небольшие порции смолы, обладающие замечательными характеристиками - высоким уровнем прозрачности, коэффициентом преломления, близким к стеклу. При фиксации канадский бальзам затвердевает, образуя прочную и долговечную защиту для изучаемого объекта. Объект в такой среде не изменяет свою структуру и не искажает своих оптических характеристик. Канадский бальзам также используется в петрографических исследованиях при изучении тонких пластинок горных минералов. В ряде случаев, для фиксации также может использоваться акрил и парафин, эпоксидные смолы.
По характеру изучаемого объекта препараты различают на следующие виды:
Тотальный – изучению подлежит или целый микроорганизм, или его отдельные части. Используют при изучении зоологии беспозвоночных, бактериологии, ботаники. Например, препарат инфузории туфельки или амёбы, споры растений, их пыльца являются тотальными.
Мазок используют для исследования в области гематологии, цитологии, гистологии и бактериологии. Он бывает влажным (изучаемому материалу не дают высохнуть) и сухим (высушивают без предварительной фиксации в специальной среде). Чаще всего мазок окрашивают "по Граму", выявляя грамоположительные и грамоотрицательные бактерии, что очень важно для диагностики инфекционных заболеваний.
Срезы бывают поперечными и продольными. Первый способ используют для изучения структуры ткани поперек оси органа. Второй - для получения радиального (по радиусу оси), тангенального (при цилиндрической структуре перпендикулярно радиусу) – например, стебель, и парадермального срезов (при плоской структуре параллельно структуре) - лист.
Срезы производятся с помощью специального прибора – микротома. Этот инструмент позволяет сделать срез необходимой толщины. За его неимением используют обычное лезвие, которое конечно не способно сравниться по точности и тонкости со специализированным прибором. Лабораторные микротомы это дорогостоящие аппараты, обеспечивающие максимально возможные точность среза и минимизацию механических повреждений ткани. Чтобы не нужно было дожидаться длительного просушивания микробиологических препаратов, были изобретены замораживающие микротомы, также называемые криомикротомами.
Шлиф – это пластинка минерала или горной породы. Исследованием шлифов занимается наука петрография. Для их изучения используются инструментальные микроскопы, широко представленные в ассортименте нашего магазина. Шлифы изготавливаются путем распиливания и шлифования породы на станках, в случае любительского использования минерал шлифуют и вручную, но это требует значительной физической силы и массы времени. Полученную ровную поверхность минерала (шлиф) приклеивают канадским бальзамом к предметному стеклу для изучения в отраженном свете, а для сверхтонких шлифов, изготовленных на станке, и в в проходящем свете. Сходные методы получения и исследования шлифов также используются в металлографии, но там изготовление шлифа обычно еще более трудоемко и практически недоступно без использования специализированного оборудования. В металлургии и петрографии также используется травление шлифов сильными кислотами для изучения их структуры под микроскопом, выявления скрытых дефектов материала.
Биологические объекты можно исследовать как живыми, так и фиксированными. В последнем случае для более тщательного изучения материал можно разделить на части и обработать различными красителями, чтобы выявить и идентифицировать те или иные структуры. Из исследуемого объекта можно приготовить временные или постоянные препараты.
Фиксация препаратов
Фиксация - это сохранение материала в состоянии, близком к естественному. Для этого необходимо быстро умертвить ткани, что лучше всего достигается с небольшими кусочками живого материала. Используемое для этого вещество называется фиксатором. Быстрой фиксацией достигается сохранение изначальной структуры объекта, причем ткани уплотняются настолько, что с них можно готовить тонкие срезы.
Обезвоживание препаратов
Обезвоживание проводится при подготовке материала к заливке или для заключения его в соответствующую среду, которая не смешивается с водой. Воду необходимо удалить также потому, что иначе препарат будет со временем разрушен бактериями. Для того чтобы сохранить ультраструктуру, обезвоживание надо проводить постепенно, обрабатывая материал рядом водных растворов этанола или про-панона (ацетона) со все возрастающей концентрацией, и закончить обработку «абсолютным» (безводным) этанолом или пропаноном.
Просветление препаратов
Некоторые из общеупотребительных сред для заливки и заключения не смешиваются со спиртом . Поэтому его надо постепенно замещать средой (просветляющим веществом), с которой заливочная среда смешивается, например ксилолом. Это приводит также к тому, что материал становится прозрачным.
Заливка препаратов
Для того чтобы с помощью микротома получить очень тонкий срез, необходимо, чтобы материал был залит в соответствующую опорную среду . При приготовлении препаратов для световой микроскопии объекты заливают в парафин, которому затем дают остыть. Для электронной микроскопии приходится использовать более твердые вещества (пластмассы или смолы), поскольку здесь необходимы особо тонкие срезы, а значит, и опора должна быть более плотной.
Различия в подготовке материалов для светового и электронного микроскоповИзготовление срезов препаратов
Как правило, толщина кусочков материала слишком велика, чтобы сквозь них могло пройти достаточное для исследования под микроскопом количество света. Обычно приходится срезать очень тонкий слой исследуемого материала, т. е. готовить срезы. Срезы можно делать бритвой или на микротоме. Вручную срезы готовятся с помощью остро отточенной бритвы. Для работы на обычном микроскопе срезы должны быть толщиной 8-12 мкм. Ткань закрепляют между двумя кусочками сердцевины бузины. Бритву смачивают жидкостью, в которой хранилась ткань; срез делают через бузину и ткань, причем бритву держат горизонтально и двигают ее к себе медленным скользящим движением, направленным чуть вкось. Быстро сделав несколько срезов, следует выбрать из них самый тонкий, содержащий характерные участки ткани.
Срез с ткани, залитой в ту или иную среду, можно сделать на микротоме. Для светового микроскопа срезы толщиной в несколько микрометров можно сделать с залитой в парафин ткани с помощью специального стального ножа. На ультратоме изготавливают чрезвычайно тонкие срезы (20-100 нм) для электронного микроскопа. В этом случае необходим алмазный или стеклянный нож.
Срезы для светового микроскопа можно приготовить, не заливая материал в среду; для этого используют замораживающий микротом. В процессе приготовления замороженного среза образец сохраняется в замороженном и, следовательно, в твердом состоянии.
Окрашивание препаратов
Как правило, биологические структуры на препаратах прозрачны , поэтому для получения контраста между ними приходится прибегать к различным средствам. Самым распространенным является окрашивание. Некоторые красители, используемые в световой микроскопии, перечислены в таблице.
Определенные красители в низких концентрациях не токсичны для живых тканей и поэтому могут применяться для окрашивания живого материала. Их называют прижизненными (витальными) красителями. К ним относятся, например, метиленовый синий и нейтральный красный.
При окрашивании парафиновых срезов парафин удаляют с помощью растворителя, а срез перед окрашиванием частично обводняют.
Полностью окрашенные срезы заключают на предметном стекле в специальную среду, например в канадский бальзам или эупарол; она не пропускает воздух, так что срез может сохраняться в ней неограниченно долго. Заключенный в среду срез накрывают покровным стеклом.
Последовательность описанных выше действий типична, когда речь идет о приготовлении тонких срезов для постоянных препаратов. Однако часто в порядок действий вносят два следующих изменения:
а) если срез сырого материала готовят вручную, то сначала делают срез, а потом его фиксируют;
б) окрашивать можно после фиксации или же в процессе обезвоживания на какой-либо его стадии. Например, красителем, растворенным в 50%-ном этаноле, можно окрасить срез после его обезвоживания в 50%-ном этаноле.
Первым шагом на пути к изучению микромира, безусловно, является выбор и покупка самого микроскопа. И если же Вам посчастливилось справиться с этим нелегким делом, Вы выбрали, какой купить микроскоп, а, может быть, уже и купили его, то можно сказать, что Вы уже практически на полпути к своей цели. И вот Вы уже достали микроскоп из коробки, собрали его, установили, настроили…, а что же делать дальше? А дальше Вам предстоит проделать немалый труд, ведь, чтобы приблизиться к миру науки, оказывается, недостаточно просто , а нужно еще научиться готовить препараты для исследования под микроскопом.
Многие производители оптических приборов выпускают детские микроскопы с уже готовыми препаратами в комплекте. Также сегодня можно купить и различные наборы готовых препаратов, так называемых слайдов, по 10, 25, 50 и даже 100 штук стеклышек разных тематик. И хотя такие наборы сравнительно недешевое удовольствие, тем не менее, они могут оказаться очень интересными и полезными как для ребенка, так и для студента медицинского института, ведь многие из препаратов просто нереально приготовить в домашних условиях.
Так среди готовых препаратов Вы можете найти образцы бактерий, срезы легких, печени, кожи человека и животных и прочие интересные образцы, которые не так уж легко, а то и вообще невозможно встретить в повседневной жизни.
Но, помимо подобных готовых препаратов, Вы можете также исследовать и различные объекты, доступные в домашних условиях. Для приготовления объектов для исследования под микроскопом Вам понадобятся предметное и покровное стекло, которые можно купить в магазинах оптических приборов.
Одним из наиболее популярных образцов, которые Вы сможете самостоятельно приготовить – это пленочка лука. Для этого сначала необходимо очистить лук от сухой шелухи, а затем аккуратно (можно с помощью пинцета) снять тонкую пленочку. На предметное стекло необходимо капнуть несколько капель воды, а затем аккуратно разместить на нем пленочку лука. Если пленочка немного скомкалась, возьмите иголочку и расправьте ею образец на стекле. После этого с помощью пипетки капните каплю раствора йода и накройте образец покровным стеклом.
Подобным образом Вы можете приготовить еще массу различных образцов из растений, овощей и пр. Следует помнить, что при исследовании объекта под биологическим микроскопом необходимо брать плоские прозрачные предметы. Биологические микроскопы предназначены для исследования в проходящем свете и имеют нижнюю подсветку, поэтому срезы растений должны быть как можно тоньше и аккуратнее. С этой целью был изобретен такой прибор, как микротом. Микротом – это такой инструмент, с помощью которого можно легко приготовить очень тонкие срезы биологических тканей. Так в комплект ко многим детским микроскопам входят микротомы, конечно же, не профессиональные, а более безопасные для Вашего малыша. Но даже если в Вашем распоряжении среди аксессуаров для препарирования нет микротома, Вы можете воспользоваться обычным лезвием или канцелярским ножом. Не стоит забывать о мерах предосторожности и безопасности Вашего ребенка, поэтому лучше не позволяйте малышу брать лезвие, нож или микротом без Вашего присмотра.
При приготовлении различных образцов Вам также могут понадобиться красители, в качестве которых Вы можете использовать раствор йода, водный раствор метиленового синего (проще говоря, «синьки»), эозина и пр.
Также Вы можете исследовать под микроскопом кристаллы сахара, соли, корень волоса, плесень (например, вырастить в чайнике чайную плесень).
Если приготовленный образец Вам не очень понравился, Вы можете попробовать очень аккуратно разъединить покровное и предметное стекло (такие препараты, которые не закрепляются надолго, называются временными), промыть их, вытереть, высушить и использовать в дальнейшем для приготовления других препаратов. Будьте особенно осторожны, так как покровные и предметные стекла очень тонкие и хрупкие, легко трескаются, а также не давайте детям играться со стеклами. Если же Вы хотите сохранить этот препарат, то перед тем, как накрывать его покровным стеклом, капните немного закрепителя (напр. пихтовую смолу или прозрачный клей) по краям образца (такой препарат будет называться постоянным). Затем придавите его и дайте высохнуть (около суток).
Вот теперь, после того как Вы успешно выполнили и этот шаг, можно приступать к самому процессу наблюдения и исследования! Желаем Вам успехов!